Zestaw do immunoprecypitacji (agaroza białka A)

 

Nazwa produktu	Kot. NIE.	Spec.
Zestaw do immunoprecypitacji (agaroza białka A)	G2215-50T	50 T

 

 

IP lub Co-IP to powszechna technika eksperymentalna służąca do badania interakcji białek lub białek (PPI) przy użyciu specyficznych przeciwciał i podłoża wiążącego przeciwciała (np. Agaroza białka A/G lub Magroza białka A/G) lub bezpośrednio przy użyciu pożywce sprzężonej ze specyficznymi przeciwciałami (np. agarozą lub kulkami magnetycznymi), a następnie izolowanie kompleksów antygen-przeciwciało ze skomplikowanych próbek białek poprzez wirowanie lub siłę magnetyczną, tak aby osiągnąć cel izolacji i oczyszczania białek docelowych, co może następnie wykorzystać do analizy Western blot lub spektrometrii mas. Białko A jest białkiem powierzchniowym ściany komórkowej występującym u Staphylococcus aureus o masie cząsteczkowej 42 kDa. Białko G jest białkiem wiążącym immunoglobulinę, wyrażanym przez bakterie paciorkowcowe typu C lub G. Białko A i białko G są funkcjonalnie podobne i mogą wiązać się specyficznie z immunoglobuliną ssaków (Ig). Rekombinowane białka A i G z odpowiednimi modyfikacjami związanymi z agarozą można stosować do immunoprecypitacji lub oczyszczania przeciwciał. Agaroza z białkiem A nadaje się do immunoprecypitacji ludzkich IgG1, IgG2, IgG4, mysich IgG2a, IgG2b, natomiast kulki agarozowe z białkiem G nadają się do immunoprecypitacji ludzkich IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, mysich IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, szczurze IgG1, IgG2a, Przeciwciała poliklonalne IgG2b, IgG2c. (Szczegółowe informacje znajdują się w tabeli I)

W tym produkcie zastosowano samodzielnie opracowaną i wyprodukowaną agarozę znakowaną białkiem A, w porównaniu z podobnymi produktami na rynku, produkt ten skuteczniej wiąże przeciwciała i ma niższą szybkość wiązania nieswoistego, wraz ze zoptymalizowanym buforem, może być wygodny i skuteczny do eksperymentów immunoprecypitacji; może być szeroko stosowany do izolacji i oczyszczania docelowych białek w próbkach takich jak lizaty komórkowe, supernatanty wydzieliny komórkowej, surowica, wodobrzusze itp.; Zestaw ten zapewnia dwie metody elucji (elucja denaturująca i elucja kwasem) w celu elucji docelowego białka, zwłaszcza elucja kwasem nie będzie zawierać lekkich i ciężkich łańcuchów przeciwciała, co może skutecznie rozwiązać problem interferencji ciężkich i lekkich przeciwciał łańcuchów w doświadczeniach immunoprecypitacji i immunoblottingu białek.

 

 

Charakterystyka	Opis
Zawartość produktu	50% (v/v) agarozy w specjalnym buforze ochronnym
Struktura koralików	6% agarozy usieciowanej
Sprzężone białko	Białko A
MW białka	~25 kDa (białko A)
Wiążąca pojemność białek	>1 mg przeciwciała mysiego na ml perełek
Specyficzność	Przeciwciała różnych gatunków, w tym myszy, ludzi, szczurów, kóz, owiec i bydła
Średnica koralika	30~150 μm
Metody elucji	Elucja kwasem lub 1x buforem obciążającym SDS-PAGE (zredukowany) Uwaga: W przypadku elucji 1x buforem obciążającym SDS-PAGE (zredukowanym), łańcuch ciężki (~ 50 kDa) i łańcuch lekki (~ 25 kDa) przeciwciała ulegną denaturacji i uwolnią się z kulek agarozowych.
Aplikacje	IP, Co-IP, Oczyszczanie białek

 

 

Statek z mokrym lodem; Bufor ładujący 5×SDS-PAGE (zmniejszony) należy przechowywać w temperaturze -20, a pozostałe w temperaturze 2-8 przez 12 miesięcy.

 

 

Numer komponentu	Część	G2215-50T	Temperatura przechowywania
G2038	Bufor do lizy IP	50 ml	2-8 stopień
G0015	10×TBS	5 ml	2-8 stopień
G2215-1	Białko SweAgarozy A	1 ml	2-8 stopień
G2215-2	Kwasowy bufor do elucji	10 ml	2-8 stopień
G2215-3	Bufor do elucji neulizacji	1 ml	2-8 stopień
G2013	5x bufor ładujący SDS-PAGE (zmniejszony)	1 ml	-20 stopień
Podręcznik		1 szt

 

 

Nazwa produktu	Kot. Numer	Spec.
50×Inhibitor proteazy koktajlowej	G2006-250UL	250 μL
PBS,1×(sól fizjologiczna buforowana fosforanami)	G4202-500ML	500ml

 

 

1. Przygotowanie zestawu

a) Zapoznaj się z poniższą tabelą, przygotuj odpowiednie odczynniki w proporcji 100-500 μl lizatu na próbkę;

Krok	Wymagane rozwiązanie	Objętość	Objętość
Liza i przygotowanie komórek	Lizat IP zawierający inhibitor proteazy koktajlowej	100 μL	500 μL
IP	Białko SweAgarozy A	4 μL	20 μL
Umyć trzy razy	1×TBS	100 μL	500μL
Elucja i neutralizacja kwasu	Kwasowy bufor do elucji	20 μL	100 μL
	Bufor neutralizujący	20 μL	100 μL
Elucja denaturująca	1x bufor ładowania SDS-PAGE (zmniejszony)	20 μL	100 μL

 

b) Przygotowanie lizatu IP zawierającego inhibitor proteazy: Patrz powyższa tabela, do lizy użyj {{0}} μl lizatu IP zawierającego inhibitor proteazy na 0,5-1 milionów komórek; zmieszać lizat IP z 50x inhibitorem proteazy koktajlowej (zaleca się G2006-250UL) w stosunku 50:1, na przykład dodać 20 µl 50x inhibitora proteazy koktajlowej do 1 ml lizatu IP, następnie 1 ml Otrzymany zostanie lizat IP zawierający inhibitor proteazy; przygotowany lizat IP zawierający inhibitor należy umieścić w łaźni lodowej lub w temperaturze 4 stopni

c) Uwaga: Jeżeli docelowe białko immunoprecypitacji obejmuje modyfikację fosforylacji lub acetylacji, należy dodać inhibitor fosfatazy lub inhibitor deacetylazy (we własnym zakresie); Lizat IP zawierający inhibitor należy przygotować przed użyciem i nie należy go zamrażać ani przechowywać do późniejszego użycia.

d) Przygotowanie 1×TBS: Rozcieńczyć bufor 10×TBS ultraczystą wodą do 1×TBS. Na przykład, dodaj 1 ml buforu 10×TBS do 9 ml ultraczystej wody, co stanowi bufor 1×TBS po dokładnym wymieszaniu.

e) Przygotowanie 1x buforu ładującego SDS-PAGE (zredukowanego): odpowiednią ilość 5x buforu ładującego SDS-PAGE (zredukowanego) rozcieńczono 5 razy ultraczystą wodą, aby otrzymać 1x bufor ładujący SDS-PAGE (zredukowany); na przykład zmieszaj 0,2 ml 5 x buforu białkowego (zredukowanego) z 0,8 ml ultraczystej wody, która jest 1 x buforem ładującym SDS-PAGE (zredukowanym).

2. Przygotowanie próbki antygenu

Eksperymenty z immunoprecypitacją lub immunoprecypitacją należy przeprowadzić natychmiast po lizie próbek. W przeciwnym razie próbki można przechowywać w lodówce w temperaturze -20 lub -80, ale zamrażanie i rozmrażanie może mieć wpływ na interakcje białko-białko; wszystkie etapy lizy próbki należy przeprowadzać w łaźni lodowej lub w temperaturze 4 stopni, aby zminimalizować degradację białka, a pewna ilość próbki powinna zostać potraktowana jako wejściowa lub całkowita po przygotowaniu próbki do późniejszej detekcji za pomocą metody Western Blot.

W przypadku próbek tkanek:

a) Tkanki należy przepłukać w zimnym PBS (zalecany G4202), aby dokładnie usunąć nadmiar krwi. Zważyć i pokroić na małe kawałki w homogenizatorze na lodzie.

b) Dodać lizat IP zawierający inhibitor proteazy w proporcji 100-200 μl na 10-20 mg tkanki lub zmniejszyć ilość lizatu IP, jeśli wymagane są wyższe stężenia białka.

c) Homogenizuj za pomocą homogenizatora szklanego lub homogenizatora ręcznego lub użyj naszego opracowanego przez siebie młynka niskotemperaturowego KZ-III-F do pełnego rozdrobnienia.

d) Homogenat przeniesiono do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml, wytrząsano i mieszano, a następnie poddano kąpieli w lodzie przez 30 minut, powtarzając przedmuchiwanie pipetą co 10 minut, aby zapewnić całkowitą lizę komórek tkankowych.

e) Wiruj przy 12,000 xg przez 5 minut w 4 stopniach, odrzuć osad i aspiruj supernatant do kolejnych eksperymentów z immunoprecypitacją lub immunoprecypitacją.

W przypadku próbek komórek przylegających:

a) W razie potrzeby komórki można przemyć 2-3 razy PBS, po raz ostatni dokładnie wchłonąć pozostałą ciecz.

b) Zeskrobać komórki skrobaczką do komórek lub trawić trypsyną komórki, aby uzyskać pełną zawiesinę, zebrać je do 1,5 ml probówki wirówkowej i wirować przy 1,000 xg przez 5 minut w 4 stopniach, odrzucić supernatant do zebrać osad komórkowy.

c) Dodać {{0}} µl lizatu IP zawierającego inhibitor proteazy na 0,5-1 milionów komórek (co odpowiada jednemu dołkowi płytki z 6-dołkami); odpowiednio przedmuchać i łaźnię lodową przez 3-5 min, aby całkowicie przeprowadzić lizę komórek, a po całkowitej lizie nie powinno nastąpić żadne wyraźne wytrącanie się komórek; jeśli ilość komórek jest większa, zaleca się podzielenie komórek na 0,5-1 miliona komórek/probówkę w celu całkowitej lizy.

d) Po wystarczającej lizie wirować przy 12,000 xg przez 5 minut w temperaturze 4 stopni, odrzucić osad i aspirować supernatant do kolejnych eksperymentów z immunoprecypitacją lub immunoprecypitacją.

W przypadku próbek komórek zawieszonych:

a) Wiruj przy 1,000 xg przez 5 minut w 4 stopniach, aby zebrać osad; w razie potrzeby przemyć raz PBS, następnie odessać pozostałą ciecz i delikatnie wymieszać na worteksie, aby jak najbardziej rozproszyć komórki.

b) Dodać {{0}} μl lizatu IP zawierającego inhibitor proteazy na 0,5-1 milionów komórek (co odpowiada jednemu dołkowi płytki z 6-dołkami); odpowiednio przedmuchać i łaźnię lodową przez 3-5 min, aby całkowicie przeprowadzić lizę komórek; jeśli ilość komórek jest większa, zaleca się podzielenie komórek na 0,5-1 miliona komórek/probówkę w celu całkowitej lizy.

c) Łaźnia lodowa przez 5 minut, wirowanie przy 12000 g w temperaturze 4 stopni przez 5 minut, pobranie supernatantu, czyli całkowitego roztworu białka, który można wykorzystać do kolejnych eksperymentów z immunoprecypitacją lub immunoprecypitacją i tak dalej.

W przypadku próbek bakterii lub drożdży:

a) Pobrać 1 ml roztworu bakterii lub drożdży i odwirować w celu usunięcia supernatantu. W razie potrzeby kuwety można jednokrotnie przemyć PBS, na koniec dokładnie wchłonąć pozostałą ciecz. Delikatnie wiruj lub potrząśnij dolną częścią probówki, aby jak najbardziej rozproszyć komórki.

b) Dodać 100-200 μl lizatu IP zawierającego inhibitor proteazy i delikatnie przedmuchać, aby całkowicie rozproszyć bakterie lub grzyby.

c) Kąpiel lodowa przez 10 minut, w celu lepszej lizy, bakterie i drożdże można strawić odpowiednio lizozymem i enzymem rozbijającym ściany (dostarczonym we własnym zakresie), a następnie poddać lizacie lizatem IP zawierającym inhibitory proteazy.

d) Wiruj przy 12,000 xg przez 5 minut w 4 stopniach, odrzuć osad i aspiruj supernatant do kolejnych eksperymentów z immunoprecypitacją lub immunoprecypitacją.

3. Przygotowanie agarozy

a) Delikatnie zawiesić kulki SweAgarose Protein A, aby utworzyć możliwie jednorodną dyspersję kulek, dodać 20 µl dobrze wymieszanej dyspersji kulek na każde 500 µl próbki, pobrać odpowiednią ilość kulek agarozowych do wyczyść probówkę EP i dodaj 1x TBS do końcowej objętości 0,5 mL (20 ul dyspersji kulek na każdą próbkę stosuje się w następujących etapach immunoprecypitacji jak przykład).

b) Delikatnie zawiesić kulki, odwirować przy 6,000×g przez 30 s w temperaturze 4 stopni, ostrożnie usunąć supernatant i powtórzyć powyższe kroki dwukrotnie.

c) Perełki ponownie zawieszono w 1x TBS zgodnie z objętością początkowej dyspersji kulek.

4. Wiązanie przeciwciał z kulkami SweAgarose Protein A

a) Przygotowanie przeciwciał: rozcieńczyć przeciwciało 1x TBS, aby przygotować roztwór roboczy przeciwciała zgodnie ze stosunkiem rozcieńczenia zalecanym w instrukcji dotyczącej przeciwciał, lub przygotować przeciwciało w roztworze roboczym przeciwciała o końcowym stężeniu 5-50 ug/ml , który można przygotować na lodzie; opcjonalnie: użyć normalnej IgG tego samego gatunku przeciwciał do przygotowania roztworu roboczego normalnej IgG o tym samym współczynniku rozcieńczenia lub stężeniu końcowym wynoszącym 5-50 ug/ml, usunąć nieswoiste wiązanie lub służyć jako kontrola ujemna. Normalna IgG tego samego gatunku oznacza, że ​​jeśli przeciwciałem zastosowanym w późniejszej immunoprecypitacji jest mysia IgG, odpowiednią ilość normalnej mysiej IgG można na tym etapie rozcieńczyć 1x TBS w celu zmniejszenia tła lub jako kontrolę ujemną.

b) Adsorpcja przeciwciał: Oddzielić kulki SweAgarose Protein A przygotowane w kroku 3 przez wirowanie przy 6,000 xg przez 30 s w temperaturze 4 stopni, odessać supernatant, dodać 500 µl roztworu roboczego przeciwciała lub normalnego roztworu roboczego IgG, ponownie zawiesić a następnie inkubować przez 15-60 min w temperaturze pokojowej na mieszadle obrotowym.

Uwaga: Możliwa jest także inkubacja perełek SweAgarose Protein A przygotowanych w etapie 3 bezpośrednio z odpowiednią ilością przeciwciała lub normalnej IgG.

c) Oddzielenie i przemycie kulek: Oddzielić inkubowane kulki przez wirowanie przy 6,000 xg przez 30 s w temperaturze 4 stopni, odessać supernatant, dodać 500 µl 1×TBS, ponownie zawiesić kulki SweAgarose Protein A delikatnie przedmuchując pipetą, odwirować przy 6,000 xg przez 30 s w 4 stopniach, usunąć supernatant, powtórzyć przemywanie trzykrotnie i ponownie zawiesić kulki w 1 x TBS w tej samej ilości, co objętość początkowa.

Uwaga: Jeśli podczas inkubacji i przemywania kulki zbrylą się lub łuszczą, jest to zjawisko normalne i nie będzie miało wpływu na wyniki eksperymentu.

5. Immunoprecypitacja (IP):

a) Usunięcie nieswoistego wiązania (opcjonalnie): kulki SweAgarose Protein A przygotowane w etapie 4, które wiążą normalne IgG, inkubuje się z próbkami w temperaturze 4 stopni przez 60 minut i oddziela przez wirowanie w temperaturze 6,000 xg przez 30 s w 4 stopniach, a supernatanty wykorzystuje się w kolejnych doświadczeniach; celem tego etapu jest usunięcie białek, które wiążą się nieswoiście z normalną IgG.

b) Inkubacja próbek z kulkami SweAgarose Protein A skoniugowanymi z przeciwciałem lub normalną IgG: dodać kulki SweAgarose Protein A skoniugowane z przeciwciałem lub normalną IgG w proporcji 20 µl zawiesiny perełek na każde 500 µl próbki białka, umieścić na boku- wytrząsarce oscylacyjnej lub mieszadle obrotowym i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C.

Uwaga 1: Jeśli podczas inkubacji i przemywania kulki zbrylą się lub łuszczą, jest to zjawisko normalne i nie będzie miało wpływu na wyniki eksperymentu.

Uwaga 2: Alternatywnie, odpowiednią ilość przeciwciała lub normalnej IgG można inkubować z próbką przez 1-2 godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 stopni, a następnie można dodać 10-20 μl zawiesiny perełek agarozowych i inkubowano przez 60 minut w temperaturze pokojowej.

c) Wiruj: po inkubacji wiruj przy 6,000 xg przez 30 s w 4 stopniach, aby usunąć supernatant.

Uwaga: Zachować część supernatantu w celu sprawdzenia efektu immunoprecypitacji.

d) Płukanie: Dodać 500 ul 1×TBS, delikatnie przedmuchać zawieszone kulki pipetą, wirować przy 6,000 xg przez 30 s w 4 stopniach w celu usunięcia supernatantu i powtórzyć płukanie trzy razy.

Uwaga: Można także oznaczyć OD280 buforu płuczącego, aby określić, czy płukanie zostało zakończone. Jeśli OD280 jest większe niż 0,05, należy odpowiednio zwiększyć liczbę czasów płukania.

6. Elucja

W zależności od charakterystyki docelowego białka i wymagań kolejnych eksperymentów, do elucji można wybrać jedną z poniższych metod.

a) Metoda elucji denaturującej: Próbki eluowane tą metodą nadają się do SDS-PAGE. Po odwirowaniu dodać 25 µl 1× buforu do pobierania próbek białka (zredukowanego) do probówki, ogrzewać w temperaturze 95 stopni przez 5 minut, a następnie wirować w celu zebrania supernatantu do wykrywania metodą Western blot.

b) Elucja kwasem: Próbka wyeluowana tą metodą zachowuje swoją pierwotną aktywność biologiczną i może być użyta do analizy postfunkcjonalnej. Po odwirowaniu dodać 20 µl kwasowego buforu do elucji do probówki, dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, następnie odwirować w celu zebrania supernatantu do nowej probówki EP i natychmiast dodać 2 µl buforu do neulizacji w celu dostosowania pH eluowany produkt do obojętnego, który można wykorzystać do analizy postfunkcjonalnej.

Uwaga: Użytkownik może dostosować ilość dodanego buforu do elucji w zależności od żądanej objętości.

 

 

1. Nie przechowuj SweAgarose Protein A w zestawie w temperaturze -20 ani wielokrotnie zamrażaj i rozmrażaj, w przeciwnym razie wpłynie to na działanie kulek magnetycznych i spowoduje niepotrzebne błędy eksperymentalne.

2. Przed wykonaniem procedury immunoprecypitacji prosimy o uważne przeczytanie niniejszej instrukcji.

3. Jeżeli docelowe białko poddane immunoprecypitacji wymaga modyfikacji fosforylacji lub acetylacji, należy podać odpowiednie inhibitory fosfatazy i deacetylazy.

4. Utrzymuj kulki w pH 6-8, unikaj wirowania z dużą prędkością, suszenia lub zamrażania, ponieważ może to spowodować aglomerację kulek.

5. Kulki przed użyciem należy dokładnie wymieszać, mieszanie powinno być delikatne i nie powinno być poddawane gwałtownemu mieszaniu i wstrząsaniu, aby uniknąć denaturacji przeciwciała.

6. Do immunoprecypitacji zaleca się kontrolę dodatnią i ujemną (SweAgarose Mouse IgG).

7. Próbki białek należy oczyścić jak najszybciej po pobraniu i zawsze umieszczać je w temperaturze 4 stopni lub w łaźni lodowej, aby spowolnić degradację lub denaturację białka.

8. Kulki agarozowe mogą gromadzić się podczas stosowania z elucją kwasem, co jest zjawiskiem normalnym i nie wpływa na normalne użycie kulek magnetycznych.

9. Ten produkt jest przeznaczony wyłącznie do użytku w badaniach naukowych przez profesjonalistów i nie może być używany do diagnozy klinicznej lub leczenia, żywności lub leków ani przechowywany w zwykłym miejscu zamieszkania.

10. Nosić odpowiednią odzież ochronną, taką jak kombinezon laboratoryjny, okulary i rękawice ochronne.

11. Zdolność wiązania białka A i białka G z przeciwciałami pochodzącymi z różnych źródeł i podtypów przedstawiono w Tabeli I.

 

Tabela 1

Gatunek	Ig	Białko A	Białko G	Całkowita Ig	Białko A	Białko G
Człowiek	IgG1	++++	++++	Człowiek	++++	++++
	IgG2	++++	++++	Mysz	+++	+++
	IgG3	-	++++	Szczur	+/-	++
	IgG4 (przeciwciała IgG4)	++++	++++	Królik	++++	+++
	IgA	++	-	Koza	-	++
	IgD (IgD)	++	-	Kurczak	-	+
	IgE	++	-	Krowa	++	++++
	IgM	++	-	Świnka morska	++++	++
Mysz	IgG1	+	++++	Chomik	+	++
	IgG2a	++++	++++	Koń	++	++++
	IgG2b	+++	+++	Świnia	+++	+++
	IgG3	++	+++	Owce	+/-	++
	IgM	+/-	-	++++:Silny Bing
Szczur	IgG1	-	+	++~+++:Średnie wiązanie
	IgG2a	-	++++	+: Słabe wiązanie
	IgG2b	-	++	+/-: Słabe lub brak wiązania
	IgG2c	+	++	-:Brak wiązania
	IgM	+/-	-

 

Tylko do użytku badawczego. Nie stosować w procedurach diagnostycznych i terapeutycznych!

 

 

Popularne Tagi: zestaw do immunoprecypitacji (białko agaroza), Chiny zestaw do immunoprecypitacji (białko agaroza) producenci, dostawcy, fabryka