Zestaw do barwienia TRAP

Winianowa kwaśna fosfataza oporna (TRAP) jest charakterystycznym enzymem osteoklastów, który jest specyficznie rozmieszczony w osteoklastach. Zestaw do barwienia TRAP służy do wizualizacji osteoklastów w tkankach. Podstawowa zasada jest taka, że ​​w warunkach kwaśnych zawierających kwas winowy, fosfataza antywinowa TRAP może hydrolizować fosforan naftolu AS-BI, a powstały naftol AS-BI wiąże się z heksaazolem-pararozaniliną, tworząc nierozpuszczalną w wodzie substancję o kolorze bordowym osadzoną w miejsce in situ aktywowane enzymem, które realizuje chromatografię i lokalizację fosfatazy kwasu winowego.

Podstawowe składniki produktu: głównymi składnikami buforu reakcyjnego są bufor kwasu octowego i winian potasowo-sodowy o pH około 5.0; roztwór pararozaniliny zawierający pararozanilinę; głównym składnikiem roztworu azotynu sodu jest 4% azotyn sodu; Roztwór substratu fosforanowego AS-BI, głównym składnikiem jest 20 mg/ml naftolu fosforanu AS-BI. Po zabarwieniu tym produktem TRAP w osteoklastach miał kolor bordowy i był zlokalizowany w cytoplazmie. W zależności od ilości 300 µl na plamkę tkanki na plasterku, zestaw może wykonać ponad 50 barwień TRAP.

Transport mokrego lodu; Przechowywać w temperaturze 2-8 i unikać światła, w którym roztwór substratu fosforanowego AS-BI przechowywany jest w temperaturze -20, ważny przez 12 miesięcy.

Przygotuj płyn roboczy TRAP:

(1) Weź 50 μL roztworu pararozaniliny (G1050-2) i 50 μL roztworu azotynu sodu (G1050-3) i wymieszaj je w czystej probówce wirówkowej, aby otrzymać roztwór heksaazolu-pararozaniliny;

(2) Dodać 100 μL roztworu substratu fosforanowego AS-BI (G1050-4) do 100 μL roztworu heksaazolo-pararozaniliny w kroku 1, a następnie kilkakrotnie przedmuchać i zassać do pełna;

(3) Zaabsorbuj 1,8 ml buforu reakcyjnego (G1050-1) i dodaj go do roztworu mieszaniny z etapu 2, dokładnie wymieszaj;

(4) Zmieszaną ciecz w etapie 3 filtruje się przez filtr igłowy (film filtracyjny o strumieniu 0,45 µm) w celu otrzymania cieczy roboczej TRAP.

Uwaga: Pamiętaj, aby przygotować roztwór roboczy w kolejności, w jakiej należy.Na każdy punkt tkanki potrzeba około 200-300 μl roztworu roboczego, który należy przygotować w zależności od użytej ilości i stosować w razie potrzeby, aby uniknąć marnotrawstwa.

1. Skrawki parafinowe odparafinowano do wody i przemywano przez kilka minut w czystej wodzie.

2. Umieścić skrawki w krążku do chusteczek chemicznych (z pewną ilością czystej wody, aby zapobiec wysychaniu skrawków) w wilgotnym pudełku i inkubować skrawki z czystą wodą w temperaturze 37 stopni przez 2 godziny.

3. Po inkubacji skrawka wylać czystą wodę, dodać przefiltrowany roztwór roboczy TRAP tak, aby przykrył tkankę i umieścić w temperaturze 37 stopni w ciemności na 20-30 min.

4. (Opcjonalnie przygotuj własne odczynniki) Barwienie kontrastowe jąder: wlać roztwór inkubacyjny i przemyć roztworem barwnika hematoksyliny w celu wybarwienia jąder.

5. Odwodnij, przeźroczysty i uszczelnij neutralną gumą.

1. Utrwalanie komórek: odsysać podłoże do hodowli komórkowej, dodać 4% paraformaldehydu (Zalecany G1101) i utrwalać przez 15-30 min, następnie przemyć wodą destylowaną 3 razy.

2. Pęknięcie błony komórkowej: Komórki przykryto 0,2% roztworem Triton X-100 na 20-30 min i delikatnie przemyto 3 razy wodą destylowaną.

3. Inkubacja i barwienie: Do płytki ze studzienkami komórkowymi dodano roztwór roboczy TRAP, aby przykryć komórki, i komórki inkubowano w temperaturze 37 stopni przez 15-20 min w ciemności i przemyto 3 razy wodą destylowaną.

4. (Opcjonalnie przygotuj własne odczynniki) Barwienie kontrastowe jądra: Osuszyć roztwór inkubacyjny i przemyć go roztworem barwiącym hematoksyliną do barwienia jądrowego.

5. Dodać odpowiednią ilość etanolu absolutnego w celu odwodnienia, wyjąć szkiełko nakrywkowe z płytki dołkowej, wysuszyć suszarką do włosów i zamknąć do góry nogami na czystym szkiełku za pomocą neutralnej gumy.

Tylko do użytku badawczego!