MitoTracker Czerwony CMXRos

 

Nazwa produktu	Kot. NIE.	Spec.
Mito Tracker Czerwony CMXRos	G1723-50UG	50 ug

 

 

MitoTracker Red CMXRos (Mitochondrial Red Fluorescent Probe) to pochodna X-rozaminy o masie cząsteczkowej 531,52, długości fali wzbudzenia 578 ± 3 nm i długości fali emisji 599 ± 4 nm. Barwnik może bezpośrednio przedostawać się do żywych komórek i lokalizować się w mitochondriach oraz jest w stanie kowalencyjnie wiązać się z mitochondriami. Zasada specyficznego znakowania mitochondriów polega na tym, że szkielet sondy o ładunku dodatnim może być zlokalizowany na mitochondriach naładowanych ujemnie, a grupa chlorometylowa na sondzie może kowalencyjnie wiązać się z wolną grupą sulfhydrylową w mitochondriach, która pełni rolę znakowania fluorescencyjnego ; mitochondria komórkowe można po prostu oznaczyć poprzez inkubację ich z żywymi komórkami przez pewien okres czasu, a po wyznakowaniu mitochondriów mitochondria można dalej przetwarzać poprzez utrwalenie i perforację, co można wykorzystać w kolejnych eksperymentach z wielokrotnym znakowaniem .

 

 

Statek z mokrym lodem; Przechowywać w temperaturze -20 stopni z dala od światła. Ważne przez 12 miesięcy.

 

 

Część	G1723-50UG
Mito Tracker Czerwony CMXRos	50 ug
Podręcznik	1 szt

 

 

1. Przygotowanie roztworu roboczego do analizy:

1.1. Produkt ma postać suchego proszku, który przed użyciem należy krótko odwirować przy dużej prędkości, aby osiadł na dnie tuby. Podaj swój własny DMSO klasy komórkowej.

1.2. Przygotowanie roztworu do przechowywania: Dodać 94 µl DMSO (na poziomie komórkowym) do probówki, przedmuchać i dobrze wymieszać do całkowitego rozpuszczenia barwnika, czyli mitochondrialnego roztworu do przechowywania barwnika fluorescencyjnego o stężeniu 1 mM (informacja o masie cząsteczkowej na etykieta produktu), a następnie krótko odwirować przy dużej prędkości, aby uniknąć utraty odczynników wiszących na ściankach. Przechowuj roztwór do przechowywania w temperaturze -20. Zaleca się przechowywać go w mniejszych rozmiarach i unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.

1.3. Przygotowanie roztworu roboczego do testu: Jeśli oznaczenie przeprowadza się bezpośrednio po barwieniu, rozcieńczyć przechowywany roztwór w mitochondrialnym roztworze roboczym do testu o końcowym stężeniu 0.1-0.25 µM buforem biologicznym (Hanks, PBS ) lub pożywka podstawowa bez surowicy; Jeśli po barwieniu wymagane są dalsze operacje, takie jak utrwalanie i perforacja, rozcieńczyć roztwór do przechowywania w roztworze roboczym do testu mitochondrialnego o końcowym stężeniu 0.4-0.6 μM buforem biologicznym (Hanks, PBS) lub pożywka podstawowa niezawierająca surowicy;

2. Barwienie komórek (poniższy protokół dotyczy komórek przylegających; do wymiany komórek w zawiesinie wymagane jest wirowanie)

2.1. Komórki sadzi się na płytkach do hodowli komórkowych lub płytkach do wspinania się komórek, aż do pewnego stopnia zbiegu;

2.2. Pożywkę do hodowli komórkowej usuwa się i przemywa 1-2 razy wstępnie ogrzanym buforem przez 3-5 min za każdym razem;

2.3. Dodać podgrzany roztwór roboczy do wykrywania mitochondriów i inkubować w temperaturze 37 stopni przez 30 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych (ze względu na różne typy i stany komórek czas inkubacji można w pewnym stopniu dostosować);

2.4. Usunąć roztwór do inkubacji i przemyć roztworem buforowym 2-3 razy przez 3-5 min za każdym razem;

2.5. Bezpośrednio lub za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu (zalecany G1401) folie zamyka się i obserwuje pod mikroskopem fluorescencyjnym (Ex=579 nm, Em=599 nm);

3. Utrwalanie i perforacja komórek oraz inne manipulacje (opcjonalnie):

Uwaga: Po zabarwieniu produkt można utrwalić i perforować, ale po utrwaleniu sygnał fluorescencyjny zostanie osłabiony.

3.1. Utrwalanie komórek

3.1.1. Komórki poddane barwieniu i przemywaniu mitochondrialnym barwnikiem fluorescencyjnym dodaje się do utrwalacza (zalecany G1101) i utrwala przez 10 minut w temperaturze pokojowej;

3.1.2. Usunąć utrwalacz i przemyć buforem 2-3 razy przez 3-5 min za każdym razem;

3.2. Perforacja komórek

3.2.1. Do utrwalonych i przemytych komórek dodaje się 0.2-0.5% Triton X-100 i perforuje się przez 10 minut w temperaturze pokojowej;

3.2.2. Płyn perforujący usuwa się i przemywa roztworem buforowym 2-3 razy przez 3-5 min za każdym razem;

3.3. Komórki są barwione, a następnie utrwalane i perforowane w celu przetwarzania, po czym można je wykorzystać w kolejnych eksperymentach, takich jak wieloznakowanie.

 

 

1. Ze względu na różne typy i stany komórek, można odpowiednio dostosować stężenie robocze barwnika i czas inkubacji.

2. Do lokalizacji mitochondriów w stanie żywych komórek należy użyć barwnika, a komórek nie można najpierw utrwalić, w przeciwnym razie doprowadzi to do fałszywie pozytywnych wyników niedokładnej lokalizacji. Utrwalenie i kolejne operacje można wykonać po wybarwieniu żywych komórek.

3. Podczas barwienia i przemywania żywych komórek roztwór roboczy testu i bufor do płukania należy wstępnie ogrzać w temperaturze 37 stopni. Barwienie i przemywanie przeprowadza się poprzez inkubację w inkubatorze, aby nie wpływać na morfologię komórek poprzez stymulację różnicą temperatur.

4. Aby zapobiec wygaszaniu fluorescencji, cały proces barwienia należy przeprowadzać z dala od światła.

5. Mieszanki główne sond należy przechowywać w oddzielnych pojemnikach, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. Aby uniknąć odpadów, roztwór barwiący przygotowuje się w miarę potrzeb, gotowy do użycia.

6. Dla własnego zdrowia i bezpieczeństwa podczas pracy należy nosić fartuch laboratoryjny i rękawiczki.

 

Tylko do użytku badawczego!